Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah metode amplifikasi suatu sekuen DNA tertentu. PCR merupakan cara yang sensitif, selektif, dan sangat cepat untuk memperbanyak sekuen DNA yang diinginkan. Spesifisitas didasarkan pada pemakaian dua oligonukleotida primer yang terhibridisasi ke sekuen komplementer di untai DNA yang berlawanan dan mengapit sekuen target. Sampel DNA mula-mula dipanaskan untuk memisahkan kedua untai; primer dibiarkan berikatan dengan DNA; dan masing-masing untai disalin oleh suatu DNA polimerase yang dimulai di tempat primer.
Kedua untai DNA masing-masing berfungsi sebagai cetakan untuk síntesis DNA baru dari dua primer. Siklus berulang denaturasi panas, penyatuan primer dengan sekuen komplementernya, dan pemanjangan primer yang telah menyatu tersebut dengan DNA polimerase menyebabkan perbanyakan eksponensial segmen DNA dengan panjang tertentu (Murray et al. 2009).
Komponen-komponen utama yang terlibat dalam proses PCR terdiri atas DNA target yang akan diamplifikasi (cetakan DNA), primer, deoksinukleotida trifosfat (dNTPs), dan enzim termostabil DNA polimerase. Molekul DNA target berfungsi sebagai cetakan untuk menghasilkan perbanyakan sekuens DNA yang diinginkan.
Primer merupakan satu fragmen DNA pendek yang berukuran 10-20 basa (b) yang berperan dalam inisiasi sintesis untaian DNA. Semakin panjang primer, maka semakin spesifik daerah yang akan diamplifikasi. DNA polimerase yang digunakan dalam proses PCR adalah Taq polimerase DNA yang diisolasi dari mikroorganisme Thermus aquaticus. Enzim ini bersifat tahan terhadap suhu panas (94 ̊C) dan memiliki kecepatan amplifikasi 2-4 kilobasa per menit atau 35-70 basa per detik. Enzim taq polymerase berfungsi sebagai biokatalis dalam síntesis untaian DNA baru, sedangkan molekul dNTPs digunakan untuk membentuk kompleks rantai baru (Bangun 2002).
Proses PCR terdapat tiga tahapan yan berulang - ulang.
yaitu :
- Denaturasi termal dengan meningkatkan suhu pada tabung reaksi sampai 95°C;
- Primer annealing merupakan tahap saat primer akan berpasangan dengan sekuens DNA cetakan (template) yang sudah dalam bentuk ss-DNA pada 35-60°C;
- Ekstensi primer, pada tahap ini suhu ditingkatkan kembali sampai 75°C yang merupakan suhu optimum untuk kerja Taq DNA polimerase yang akan memulai reaksi pada ujung 3‟-hidroksil dari primer.
Selain DNA cetakan dalam reaksi PCR juga diperlukan primer oligonukleotida, DNA polimerase termostabil (misalnya Taq DNA polimerase), empat macam deoksiribonukleotida (dNTPs), dan buffer PCR pH tertentu (Surahman et al. 2007).
Konsentrasi DNA dan MgCl2 mempengaruhi hasil amplifikasi PCR. Konsentrasi DNA yang lebih tinggi atau lebih rendah dari konsentrasi optimum menghasilkan pola pita DNA yang lebih sedikit dan kurang baik. Konsentrasi MgCl2 yang lebih rendah atau lebih tinggi dari konsentrasi optimum menghasilkan jumlah pita yang lebih sedikit. Konsentrasi Taq DNA polimerase berpengaruh pada ketajaman pita DNA. Konsentrasi emzim Taq DNA polimerase yang tinggi menghasilkan intensitas pita DNA yang lebih tajam dibandingkan hasil amplifikasi dengan konsentrasi enzim yang lebih rendah (Lengkong et al. 2001).
Untuk mencapai amplifikasi DNA yang optimum diperlukan kondisi reaksi yang optimum yang ditentukan misalnya oleh konsentrasi DNA cetakan, konsentrasi magnesium, konsentrasi Taq DNA polimerase, konsentrasi primer dan dNTPs, suhu annealing, waktu dan jumlah siklus tertentu. Oleh sebab itu, perlu ada optimasi PCR. Disamping itu, keberhasilan juga ditentukan oleh primer yang baik. Persyaratan primer yang baik antara lain adalah bebas dari kemungkinan terjadinya primer-dimer dan formasi self-complementarity, serta stabilitas internal yang tepat (Surahman et al. 2007).
Belum ada tanggapan untuk "Polymerase Chain Reaction"
Post a Comment